V prvním dějství objasňuje právní zástupce doktor Kolenatý svůj probíhající případ, který se táhne již po několik generací, nejen divákovi (čtenáři), ale především zpěvačce Emílii Marty, která zná některé podrobnosti z minulosti a ví o důležitých důkazech, jež mohou ozřejmit celý případ. Divák může Emílii považovat za šílence , stejně jako doktor Kolenatý, nebo jí může důvěřovat jako Albert Gregor, jehož případu se tyto údaje týkají.
Rozhodně žena působí ještě záhadněji, když se jí popisované dokumenty skutečně najdou tam, kde uvedla. Emílie se nesnaží pomoci vyřešit soudní případ, jak si lze zpočátku oprávněně myslet, stojí pouze o dopisy, které jsou uchovány společně se závětí v Prusově domě. Vyhovuje jí ovšem, že je ostatními (především Gregorem) považována téměř za spasitelku , a blahosklonně přijímá dary, jak je tomu zvyklá ze své pěvecké kariéry a z úspěchů z celé Evropy .
Proces „Gregor versus Prus“ (v současné době Albert Gregor proti Josefu Prusovi) je sice na dobré cestě k vyjasnění, zároveň se však ještě více zamotává, neboť je nezbytné prokázat totožnost hlavních účastníků, především vzájemný vztah Ferdinanda Makropula s Ellian Mac Gregor.
Druhé dějství, které se odehrává v divadle po skončení Emíliina koncertu , kde zpěvačka kromě přijímání gratulací k svému dnešnímu výkonu od okouzlených obdivovatelů vyjednává s Prusem a Gregorem o zalepeném dopise určeném „synu Ferdinandovi“, který byl mezi nalezenými dokumenty. Když jí ho nechce vydat Josef Prus, snaží se jej vymámit na jeho synu Jankovi, kterého rovněž zasáhlo zpěvaččino kouzlo. Kromě Josefa a Janka Prusových se zde setkáváme opět s Kristinou (milou Janka Pruse a dcerou solicitátora Vítka z advokátní kanceláře doktora Kolenatého, která se touží stát výtečnou a uznávanou zpěvačkou a Emílii bezmezně obdivuje po profesionální stránce), dále s Albertem Gregorem, s Vítkem a nově s Hauk-Šendorfem, který Emílii považuje za španělskou zpěvačku a tanečnici Eugenii Montez. Celkovou atmosféru divadla po představení dokreslují postavy poklízečky a strojníka.
Třetí dějství začíná ránem v hotelovém pokoji, kde Prus předává Emílii obálku, kterou jí slíbil vydat, když s ním stráví noc. Tím tak předešel i tomu, aby mu Janek obálku pro Emílii ukradl. Ovšem zapříčiní tím, že se mladík ze žárlivosti zastřelí. Protože se podpis Ellian Mac Gregor na vlastnoručním prohlášení o tom, že je matkou Ferdinanda Gregora, příliš podobá podpisu Emílie Marty na fotografii, kterou obdarovala svou obdivovatelku Kristinu, přicházejí všichni ostatní a žádají od zpěvačky vysvětlení. Částečně opilá Emílie v absurdně zinscenovaném procesu prozradí, že je dcerou rudolfínského lékaře, který pro svého císaře objevil elixír mládí na 300 let a vyzkoušel ho právě na ní. Elina Makropulos, což je Emíliino pravé jméno, se dožívá 337 let a ačkoli ji život nudí, nejvíce ze všeho se bojí smrti . Proto chce získat dopis, ve kterém je návod na přípravu elixíru. Během procesu si však sama uvědomuje, že nelidsky dlouhý život je horší než smrt. I ostatní se nakonec vzdávají plánů s receptem na věčný život a nechávají Kristinu, aby pergamen spálila.